テロメラーゼは、ほぼすべての真核細胞でテロメアを維持する責任リボ核タンパク質です。 酵素は、ヒト染色体の末端に繰り返すD（TTAGGG）の逆転写のためのテンプレートとしてのRNAサブユニットの短いセグメントを利用することができます。 テロメラーゼのトランスフェクションは、ヒト細胞のいくつかの種類の不死性を与えることが示されました。 また、テロメラーゼの活性化は、正常細胞の悪性形質転換のために必要なキーイベントの一つであると思われます。 培養中の細胞増殖の停止中に形質転換された細胞の結果におけるテロメラーゼ活性の阻害とは、抗癌治療の標的としてのテロメラーゼの選択のための理論的根拠を提供します。 ＆＃のx02192;オリゴヌクレオチドN3＆＃x02032を使用してP5＆＃のx02032。 ホス（NPS）らは、ヒトテロメラーゼRNAサブユニット（のhTR）＆＃のx0223c領域を同定した。100ヌクレオチド下流その構造的完全性テロメラーゼ酵素活性のために重要な表示されるテンプレート領域から。 hTRのこのセグメントを標的とするオリゴヌクレオチドは、生化学アッセイにおけるテロメラーゼ活性の強力かつ特異的な阻害剤です。 hTRの3 NTは15 ntのNPに相補的ではないされた突然変異体テロメラーゼは、そのオリゴヌクレオチドによる阻害に対して不応性であることが判明しました。 また、これにオリゴヌクレオチド、NPの結合が酵素のテロメラーゼ基質（一本鎖DNAプライマー）の親和性の著しい減少にアロステリック部位の結果をHTRことを実証しました。 導入 テロメラーゼは、ほぼすべての真核細胞中でのテロメアの維持に関与する酵素です。 これは、逆転写のためのテンプレートとしてのRNAサブユニット内の短い配列を用いるリボ、合成D脊椎動物においてヘキサヌクレオチドD（TTAGGG）を含む繰り返すリッチ（TG）である（1）。 ヒト組織において、テロメラーゼ活性は、ほとんどの体細胞または分化した細胞（2）胚内で検出し、幹細胞ではなくすることができます。 テロメラーゼ活性の欠如が原因線形染色体（3）の端部を複製するために、従来の複製機構を不能にテロメア侵食につながります。 そのテロメアは（4）を短くするとき、in vitroで培養した細胞は老化を受けることができます。 細胞内での種々のウイルス発癌タンパク質の発現は、彼らが成長停止して、再入力して、細胞周期（5）のこの状態を回避することができます。 しかし、いくつかの重要なポイントで、染色体不安定性＆＃x02014におけるテロメラーゼ活性の結果の不存在下で細胞増殖を続け、細胞危機（6,7）として知られる現象。 危機は通常、培養液中で増殖した細胞を指すが、マウスにおいて、テロメラーゼRNA遺伝子ノックアウトからのデータが強く類似のイベントが生体内でも発生する可能性があることを示唆している（8、9）。 危機の間に、集団内のほとんどの細胞がアポトーシス死を起こします。 まれに、細胞は、ほぼ常に、テロメラーゼ活性（10）の再取得に付随している、危機から出てくることができます。 テロメラーゼを発現する細胞は（11＆＃x02013; 13）線維芽細胞では、網膜色素上皮細胞および内皮細胞はまた、増殖不死のために十分であるように思われ、不滅である可能性があります。 さらに、テロメラーゼの発現は、悪性腫瘍（15）の大部分にテロメラーゼ活性をリンク先に相関関係を説明するのに役立つ、インビトロおよびインビボでの細胞の悪性形質転換のために必要ないくつかのキーイベント（14）のいずれかです。 これは、同様に過剰発現酵素のドミナントネガティブ型の危機（16）への腫瘍細胞株を駆動することができることを知見は、抗癌治療のための魅力的な標的としてのテロメラーゼを選択するための根拠を提供しました。 試験管内で 。 テロメラーゼは、D（TTAGGG）の付加を触媒する一本鎖DNA基質上に繰り返します。 二つのテロメラーゼ成分は、必要とin vitroでの活性のために十分です。 RNAは、その一部は、ヘキサヌクレオチドリピートの合成のための鋳型、および触媒サブユニットを含むタンパク質として機能します。 脊椎動物テロメラーゼRNAは、長さが類似しており、最近の二次構造は、系統発生比較（17）に基づいて、提案されています。 いくつかの保存されたドメインは、この比較から現れました。 5＆＃x02032では、RNAの-half、推定シュードノット構造は、テンプレート領域に加えて、同定されました。 3つの保存ドメインはまた、3＆＃x02032で見つけることができ、分子の-half。 これらの一つは、ボックスH＆＃1 x0002f; ACAドメインは、ヒトテロメラーゼRNA（hTRの）において以前に認識し、RNAプロセシングおよび安定性（18）のために不可欠であることが見出されました。 コアH＆＃のx0002f;（; 21 19＆＃x02013）、おそらくテロメラーゼホロ酵素の一部であるACAのsnoRNAタンパク質はhTRのと相互作用することが示されています。 酵母で同定されたテロメラーゼのタンパク質成分（TERTs）は、繊毛虫および哺乳類のサイズが類似している（＆＃のx0223c; 100＆＃1 x02013; 130 kDaの）が、配列相同性のそれらの領域は、遺伝子産物のごく一部に限られています 。 TERTs（22）の中でユニークなモチーフを表すアミノ酸の小さなストレッチがあるが、相同性の大部分は、他の逆転写酵素（RTS）と共有されます。 これらのRTモチーフは、単一のアミノ酸置換は、テロメラーゼ活性廃止することが示されているように、重要な構造要素である（23＆＃x02013の; 26）。 この情報は、触媒サブユニットのための阻害剤の設計を支援するには、しかし、ユーティリティが限定されています。 ヌクレオシド類似体から離れて、付加的な構造情報が存在しない場合には、テロメラーゼの活性部位の阻害剤を選択するための合理的なアプローチを検討することは困難です。 RNA成分は、一方で、そのような合理的なアプローチにより適し表示され、阻害オリゴヌクレオチドベースのアプローチのための理想的な候補であり得ます。 実際、いくつかの酵素の強力な阻害剤としてテンプレート領域に相補的なオリゴヌクレオチドを記載したレポート（; 30 27＆＃x02013）がありました。 私たちは（; 1nMで、x0223cの＆＃IC 50値R. PruzanとS. Gryaznov、未発表データ）のhTRのテンプレート領域と相補的な修飾オリゴヌクレオチドを設計しており、これらの化合物は、in vitroでの高い効力でテロメラーゼを阻害することが見出されています。 ＆＃のx02192; P5＆＃のx02032これらはN3＆＃のx02032です。 ホスホラミデート（NP）、オリゴヌクレオチド、3＆＃x02032;アミノ基は、3＆＃x02032に置換され; 2＆＃x02032で - 酸素; - deoxyriboseリング。 これらの化合物は、一本鎖RNAとの非常に安定な二重鎖を形成することが示されている、ヌクレアーゼ分解し、タンパク質（31）に対して比較的低い親和性で、RNAおよびDNA標的に対して高い特異性を表示するために抵抗性です。 hTRのテンプレート領域を標的NPオリゴヌクレオチドが強力なテロメラーゼ阻害剤であるが、我々はNPオリゴヌクレオチドによる阻害に感受性であるかもしれないRNAの追加の領域を見つけることに興味を持っていました。 我々は、この領域に相補的なNPオリゴヌクレオチドによる阻害を受けやすいテンプレート領域から約100ヌクレオチド下流のhTRのセグメントを同定しました。 その領域へのNPのオリゴヌクレオチドの結合の際に、我々は、酵素のための一本鎖DNAプライマーの親和性の顕著な減少を発見しました。 材料および方法 テロメラーゼ抽出物および活性アッセイ テロメラーゼは、骨髄増殖性肉腫ウイルスプロモーター（MPSV）を用い、hTERT遺伝子を過剰発現さ293懸濁細胞から調製しました。 全細胞抽出物を、凍結細胞ペレットから調製しました。 細胞ペレットをx02018の＆＃1パック細胞容積に再懸濁した; H＆＃x02019を。 バッファ＆＃のx0005b; 10mMのHEPES pHが7.9、1＆＃x000a0;のMgCl 2。 1mMジチオスレイトール（DTT）、1mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）、0.5＆＃x000b5; G＆＃のx0002f; mlのロイペプチン）とは、その後、ダウンスホモジナイザーで細胞を溶解します。 分、次いで100 000 gで遠心分離し、溶解物中の塩の濃度は、15＆＃x000a0撹拌した0.3MのNaClに調整しました。 固体硫酸アンモニウムを上清（42＆＃x00025;飽和）に添加し、不溶性タンパク質をペレット化しました。 ペレットは、その元の体積の五分の一に再懸濁し、バッファ＆＃x02018に対して透析した。A＆＃x02019を。 ＆＃のx0005b; 20mMのHEPES＆＃x02013; KOHのpH 7.9、1mMのMgCl 2。 1mMのDTT、1mMのエチレングリコール - ビス（＆＃のx003b2;アミノエチルエーテル） - N、N、N＆＃1 x02032。 、N＆＃のx02032。 - 四酢酸（EGTA）、10＆＃x00025。 グリセロール＆＃x0005d。 0.1MのNaClを含みます。 透析後抽出物は、不溶性物質を除去するために、25000 gで遠心しました。 テロメラーゼは、2＆＃x02032を使用して、以前に記載した方法と同様のアンチセンスアフィニティークロマトグラフィーにより精製した; - O - Me RNAのhTR（32、33）のテンプレート領域に相補。 アフィニティー精製された抽出物を、さらにゲル濾過クロマトグラフィー（G5000PW、東ソーBIOSEP LLC）によって精製しました。 hTRの定量的ノーザンブロット分析によって、および予め結合プライマーを単一ヌクレオチド付加を可能条件を用いて活性を測定することによって決定される抽出物は、抽出物の1mlあたりテロメラーゼの0.1及び0.2 pmolの間に含まれます。 活性は100 nMのプライマー＆＃x0005bとテロメラーゼ抽出液をインキュベートすることによって決定したと、d（TTAGGG）3＆＃x0005d ;, 200＆＃のx000b5; MのdTTP、50＆＃x000b5; MのdGTP、10＆＃x000b5; MのdATP、10 ＆＃のx000b5、Ciの＆＃のx0005b;＆＃のx003b1; - 33 P＆＃のx0005d;のdATP（2000＆＃x02013、4000 Ciの＆＃のx0002f;ミリモル）を50mMを含む緩衝液中（Nは-2-ヒドロキシエチルピペラジン、N＆＃のx02032 ; -3プロパンスルホン酸）＆＃のx02013;水酸化ナトリウムpHが8.5、1＆＃x000a0;のMgCl 2。 1＆＃x000a0; mMのDTT、5＆＃のx00025。 40＆＃のx000b5の最終反応容量中のグリセロール、0.5mMのEGTA及び100mMのKOAc、L。 インキュベーションは、日常的に37＆＃x000b0で90分間行われた; Cを。 200＆＃x000b5の最終容量で、、EDTA（2.5 mM）のおよびNaCl（MM 100＆＃x000a0）;反応をSDS（0.1＆＃x00025）で終了しましたL。 一本鎖DNA（50＆＃x000b5; g）はピロリン酸ナトリウム（5ミリモル）と一緒に加え、 反応は、5＆＃x00025に調整しました。 トリクロロ酢酸（TCA）（W＆＃x0002f; v）を、30分間氷上に設定することができました。 遠心分離後、ペレットを水に懸濁させ、冷5＆＃x00025で再沈殿; TCA（W＆＃x0002f; v）です。 1＆＃x00025で洗浄し、;（シュライヒャーおよびシュエル。無31）沈殿物をガラス繊維フィルター上に集めました。 冷たいTCA（W＆＃x0002f; V）をエタノールに続きます。 フィルタは、空気が乾燥し、シンチレーション液の添加後に計数しました。 プライマーを添加せずに行われる反応に由来したバックグラウンド計数は、（または5mMのEDTAの存在下で）総数から差し引きました。 酵素阻害は、阻害剤濃度の対数の関数としての酵素活性をプロットすることにより行いました。 IC 50値を、カレイダグラフソフトウェアパッケージ（相乗効果）を使用してデータを次式フィッティングによって得た：Y＆＃x000a0と、 ＆＃のx0003d;＆＃のx000a0。 B＆＃x0002b。 （A＆＃x02013と、b）＆＃のx0002f;＆＃x0005b; 1＆＃x0002b。 10 EXP（C＆＃x02013を記録し; X）＆それぞれ、S字曲線の底部と上部の値を表し、cは、阻害剤の濃度を表すBと＃のx0005d ;,ここ50＆＃x00025。 活性（IC 50）が観察されます。 ネイティブゲルを用いてNPオリゴヌクレオチドの結合 32 P＆＃x0005d、ATP及びポリヌクレオチドキナーゼ - ;＆＃のx003b3; NPオリゴヌクレオチドは、使用して＆＃のx0005b標識しました。 2000＆＃x02013の具体的な活動; 4000 CPM＆＃x0002f;オリゴヌクレオチドのfmolのが得られました。 20＆＃x000b5の容量で室温で30分間、アフィニティー精製テロメラーゼ（1 fmolのは）標識オリゴヌクレオチド（nMの2＆＃x000a0）とインキュベートしたリットル。 各サンプルの半分を、プロテイナーゼKで処理した（100＆＃x000b5; G＆＃x0002f;ミリリットル、0.2＆＃のx00025; SDS）; C 37＆＃x000b0で10分間。 試料は、未変性ゲル上での電気泳動によって分析しました。 ゲル（140＆＃x000d7; 170＆＃のx000d7; 1.5ミリメートル）は3.5＆＃x00025が含まれていました。 アクリルアミド（1:60ビスアクリルアミド）、0.5＆＃x00025。 アガロース、75 mMトリスおよび75 mMグリシン。 ゲルを30分間プレランした後、キシレンシアノール色素を10cmに移行するまで、200 Vで電気泳動しました。 ゲルを乾燥し、ホスファーイメージャ（分子動力学）を用いて分析しました。 プライマーの解離速度の決意 ミッチェルとコラール1セキュアなチーム初の表彰台 - 2ニュースに戻ります スラクストン、週末のラウンド7、8および9英国最速の回路に向かったアーデンのジュニアレーシングチーム。 チームは、P1、P2およびP4を実行して、土曜日の午前中に予選のオープニングラップで非常に強い探していました。 ピットストップのためで来て最初なので、サンディ・ミッチェルは、タイヤとフロントウィングの変更のために入ってきて、その後10分の8、（：13.264 1）で予選を支配するようになりました。 彼は最後のラップ（1：14.100）でP5にドロップとしてリッキーコラールはただ、第4位の間だけで0.021秒とP4を逃したとEnaamアーメドは、P14（：14.661 1）を終えました。 ポールポジションからスタート、サンディ・ミッチェルは、ダブルRのマテウスLeistと泉南フィールディングのJHR開発車の後ろに3位に滑り、彼の休暇を誤解。 原因インシデントおよび鎖車に、セーフティカーは6周目まで外泊オープニングラップの最後にトラックに出てきました。 以下のひざの上に教会を介して第2およびLeistを確保するためにウッダムヒルをフィールディングに飛びかかる、サンディはリードを奪い返します。 ハンプシャーのリッキーコラールが行くための唯一の3周で7位で実行されているレースを通していくつかの場所を落とし、彼はチャンピオンシップリーダーFortecのDaniel Ticktumに彼のポイントの赤字を狭くするために彼を助けること、第四にラインを通過するためにパックを介してブラスト。 Enaamは14番目から素晴らしいスタートを切りました。 トップ8で3アーデン車を作るために第八の線と交差するようにドロップダウンする前に、レースの50％以上のための6番目に滞在し、最初のラップの終わりまでに8箇所を獲得。 スラクストンに到着した観客数千人のための治療 - トップ7の仕上げは、日曜日の朝のレースのためのスターティンググリッドのために逆転しました。 サンディは7番目から始まります。 8位で彼の後ろEnaamは、わずか4回目からの逆格子ポールとリッキーのための1つの位置によって逃し。 20分のスリップストリームの戦いは、3つの異なるドライバーが最終ラップまで不確定なままに、結果を率先しました。 彼の日齢のラップレコードを破る、サンディは最後のラップで2位を確保パックを介して充電。 リッキーは、わずか0.4秒は4位入賞に2番目をカバーとしてだけで表彰台を逃し、3周目に1/8に滑り落ちた後、4番目にカムバックを作りました。 Enaamは7番目の行を横断し、新人クラスの表彰台に第三のステップを作り、それを別の3アーデンカートップ8フィニッシュしました。 リッキーはTRSアーデン1-2の結果にする15歳のサンディ・ミッチェルホーム次の日曜日の午後にレース3の後にチャンピオンシップテーブルの上に登りました。 サンディは再びポールポジションからスタートし、彼の前の2つのレースのレースの99％のためのフラグにライトを導き、彼の第二のカーレースのキャリアの勝利を主張するよりも良いスタートを切りました。 これは、リッキーのためのダイシングレースだったが、彼は5周後に、次に場所を取り戻すためにノリス七膝の上にとのためのカーリンのランドーノリスから2位を獲得としてレースは終わっていませんでした。 リッキーは、第2取り戻し、表彰台に第二のステップを取るために家に持って来ました。 Enaamは、ドライバの両方のと新人選手権のためのより多くのポイントを家に持って来る第13から10番目の行を横断。 サンディ・ミッチェルのコメント：「何レースの素晴らしい週末2レースに勝っていたし、一人で二は素晴らしいですが、すべての3レースのためのMSA式クラスとトップルーキーのための新しいラップレコードを設定したとするには、単に素晴らしいですそれがあります。 偉大な感じの私の最初のシングルシーターの勝利を得るために、私はちょうどTRSアーデンと助け、あなたに感謝し、私をサポートしてすべての人にそんなにみんなに感謝したいと思います！」 Enaamアーメドのコメント：「私は自分のレースでは良い進歩を遂げました。 私は半ばから来グリッドの前に荷造りすることができましたし、トップの男に滞在することができました！ 私は実際に6月の初めにオールトン・パークを楽しみにしています。」 マイホーム回路は、チャンピオンシップのリードを私に与えられ」、そして偉大なチームのパフォーマンスは私たちにかなりのリードを与えた：リッキーコラールはコメントしています。 車は、すべての週末を素晴らしいと感じたチームと私は、両方のチャンピオンシップでのリードを維持確保するために日々改善を行っています。」 バックグラウンド BAXインヒビターペプチドP5（BIP P5）は、ミトコンドリア[1]〜バックス転座のペプチド阻害剤です。 BIP P5はミトコンドリアへのBax転座の膜透過性ペプチド阻害剤です。 HeLa細胞において、BIP P5はUVC-及びSTS誘発性アポトーシスから細胞を保護しました。 U87-MG神経膠腫細胞、MCF-7乳癌細胞およびLNCaP前立腺癌細胞においては、BIP P5は、抗がん剤、シスプラチン、エトポシド、およびドキソルビシンによって誘導されるアポトーシスを阻害しました。 BIP P5は、BIP P5のみBax媒介アポトーシスを抑制したが示唆された、Baxの欠損細胞（DU145）にUVC-またはSTS-誘導アポトーシスを抑制しなかったが。 カスパーゼ活性化およびアポトーシス刺激によって誘発ミトコンドリアからのシトクロムcの放出は、また、著しくBIP P5によって阻害されました。 BIP P5は、用量依存的方法[1]でのKu70と内在性Baxの相互作用を阻害しました。